preventavir

Фекальная панкреатическая эластаза инструкция и описание

Фекальная панкреатическая эластаза 1
(Рancreatic Elastase 1 Stool Test)
1. Введение
1.1 патобиохимии
Человеческая панкреатическая эластаза 1 (Е1) остается неизменной в течение прохождения через кишечник. Поэтому ее содержание в фекалиях отражает экзокринной функции поджелудочной железы. При развитии воспаления поджелудочной железы Е1 попадает в кровь, поэтому определение панкреатической эластазы 1 в сыворотке может подтвердить или опровергнуть диагноз острого панкреатита.
1.2 Преимущества
В отличие от общих приемлемых лабораторных параметров диагностики заболеваний поджелудочной железы - активности химотрипсина в кале, панкреатическая эластаза 1 имеет следующие преимущества:
- Е 1 абсолютно специфична для поджелудочной железы.
- Поскольку, Е1 стабильна в течение прохождения через кишечник, содержание фекальной эластазы 1 отражает секреторные возможности поджелудочной железы (диагноз или исключения внешне секреторной панкреатической недостаточности).
- Определение Е1 хорошо коррелирует с "золотым стандартом" - секретин-панкреозимин и секретин-церулеин инвазивными тестами.
- Индивидуальные вариации Е1 незначительны.
- Заместительная терапия не влияет на определение Е 1. Моноклональные антитела, используемые в тесте, не имеют перекрестной реакции с эластазы животных, содержащихся в ферментных препаратах.
- Как и другие панкреатические энзимы, Е1 высвобождается в кровоток при воспалении. Благодаря большему периода полувыведения, чем в амилазы и липазы, ее концентрация остается высокой дольше, таким образом диагноз острого панкреатита может быть установлен даже через 3-4 дня после возникновения болезни.
Два тестовых наборы ELISA (основанные на моноклональных антител) предназначены для определения панкреатической эластазы 1. С помощью сывороточного теста определяют Е1 в сыворотке крови с целью установления или опровержения диагноза острого панкреатита или хронического панкреатита, а также для диагностики панкреатитов, обусловленных ретроградной панкреатохолангиография или желчно-каменной болезнью. С помощью определения фекальной Е1 диагностируют или исключают панкреатический внешне секреторную недостаточность, которая может развиваться при хроническом панкреатите, муковисцидозе, опухолях поджелудочной железы или сахарном диабете.
1.3 Чувствительность и специфичность
Диагностическая эффективность определения панкреатической эластазы 1 в кале была изучена в различных клинических исследованиях. Соответственно, Stein et al. (1993, 1996 & 1997) и Loser et al. (1995 & 1996) сравнили определения Е1 с инвазивными интубационная тестами - секретин-панкреозимин и секретин-церулеин тестами. Оба автора установили чувствительность и специфичность более 90% при установлении внешне секреторной недостаточности. В отличие от определения химотрипсина, даже умеренная панкреатическая недостаточность может быть установлена ??путем определения Е1 (Loser et al.).
В исследовании, которое проводилось Dominguez-Munioz et al. (1995), определение Е1 сравнивалось с панкреоауриловим тестом. Согласно результатам, специфичность Е1 была более высокой при приблизительно равной чувствительности.
Кроме того, исследования Terbrack et al. (1996), Soldan et al. (1996), Gullo et al. (1997) и Littlewood et al. доказали отличную чувствительность и специфичность для диагностики муковисцидоза с поражением поджелудочной железы.
1.4 Основной принцип метода
На пластинке ELISA размещают моноклональные антитела, отвечающие за человеческую пакреатичну эластазу 1 (Е1). Добавляют пробы и стандартные образцы. Содержание фермента определяется на основании интенсивности перекисного окисления АБТС (2, 2 (- Азино - бис - (3-етилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) диамониева соль), цвет которой меняется на темно-зеленый. Концентрация окисленной АБТС измеряется путем фотометрии.
1.5 Пределы измерения
Панкреатическая эластаза 1 может быть определена в интервале от 0,3 до 10 нг / мл. Это соответствует концентрации энзима в фекалиях между 15 и 500 mгЕ 1 / г фекалий и дуоденальной концентрации между 6 и 200 mгЕ 1 / мл дуоденального сока. Концентрация, меньше низкий стандарт, оценивается как <15 mгЕ 1 / г фекалий или <6 mгЕ 1 / мл дуоденального сока.
1.6 Точность
Внутренне лабораторная вариабельны была определена путем 20 двойных исследований 7 анализов кала (36-450 mгЕ 1 / г фекалий). Средний коэффициент вариабельности (КВ) составил 5,8% (3,3-7,5%).
Внешне лабораторная вариабельность была подсчитана при исследовании 7 анализов, которые исследовались в течение 10 различных дней. Средний КВ был 7,7% (4,1-10,2%; Scheefers-Borchel et al., 1992).
1.7 Возможные воздействия на результаты измерений
В настоящее время известны факторы, которые не способны влиять на результаты теста, например, ферментативная заместительная терапия не влияет на результаты определения эластазы 1. В очень редких пробах фекалий, в результате разведения, результат определения концентрации Е1 может быть заниженным. Поэтому рекомендуется записывать консистенцию фекалий. В случаях, когда получается патологический результат (<200 mгЕ 1 / г фекалий), необходимо провести повторное исследование более оформленного кала.
2. Реактивы
1. 12 пластинок ELISA, с 8 ячейками, каждая с моноклональными антителами к человеческой панкреатической эластазы 1 (Е1),
      96 ячейки.
2. Концентрированный буферный раствор (5х) (черная крышка) 100 мл,
      фосфатный буфер, рН 7,2, со стиральным порошком.
3. экстрагируют чей буфер (5х) для проб кала (квадратный
      флакон, зеленая крышка) 100 мл,
      фосфатный буфер, рН 7,2, со стиральным порошком и азид натрия.
4. Е1 стандарты от 1 до 5, пригодные к употреблению (синяя крышка)
     700 mл в каждом,
      человеческая панкреатическая эластаза 1 в водном растворе с азидом натрия.
5. Контроль, пригодный для потребления (фиолетовая крышка) 700 mл,
      человеческая панкреатическая эластаза 1 в водном растворе с азидом натрия.
6. Второй тип моноклональных антител к Е1, конъюгированной с биотином
    (Анти 1-био) (желтая крышка) 150 mл,
    в водном растворе с азидом натрия.
7. ПОД-стрептавидин, светочувствительный (зеленая крышка) 15 мл,
    в водном растворе.
8. Раствор субстрата, пригодный для потребления, светочувствительный (красная
    крышка) 15 мл,
    АБТС в водном растворе.
9. Стоп раствор, пригодный для потребления (белая крышка) 15 мл,
    щелочной водный раствор.
10. Пластиковый пакет с влажно сорбентом для неиспользованных пластинок ELISA.
3. Материал для проб и стабильность проб
Материал проб: небольшое количество фекалий или дуоденального сока
Стабильность проб: пробы могут храниться трое суток при температуре
                                4-8 0С или до года при температуре - 200 ° С.
                                  Экстракт фекалий можно хранить при температуре
                                4-8 0С в течение одного дня.
4. Хранение и стабильность тест-набора
Все компоненты тест-набора стабильны при температуре 4-8 0С до конца срока годности, который указан на упаковке. Неиспользованные пластинки ELISA должны храниться в хорошо запечатанном пластиковом пакете, содержащем влажно сорбент.
5. Предостережение
Только для диагностики in vitro. Буфера для экстракции, стандарты, контроль и анти 1-био содержат от 0,05% до 0,1% NaN3 в качестве стабилизатора.
Нельзя смешивать материалы различных партий.
6. Процедура теста
6.1
6.1.1 Подготовка тестового / моющего буфера
100 мл концентрированного буфера 5х (черная крышка) + 400 мл бидистиллированной воды. Разбавленный тестовый / моющее буфер годен в течение 6 месяцев при температуре 4-8 0С.
6.1.2 Подготовка буфера для экстракции
100 мл буфера для экстракции 5х (квадратный флакон, зеленая крышка) + 400 мл бидистиллированной воды. Разбавленный буфер для экстракции годен в течение 6 месяцев при температуре 4-8 0С.
6.1.3 Подготовка пластинки ELISA
Оставьте пластинку при комнатной температуре перед открытием. Неиспользованные пластинки ELISA должны храниться в хорошо запечатанном пластиковом пакете, содержащем влажно сорбент.
6.1.4 Подготовка проб фекалий
Пробы могут быть взвешены (преобладающий способ) также могут использоваться дозирующие приборы.
6.1.4.1 Взвешивание проб фекалий
Используйте для взвешивания проб цифровые лабораторные весы. Необходимо отколоть небольшой кусочек фекалий (примерно 100 мг).
Добавьте к пробному образца буфера для экстракции, в соответствии с массой образца: 100 мг - 10 мл буфера; 75 мг - 7,5 мл экстракта. Конечная концентрация должна быть 10 мг фекалий / мл буфера для экстракции.
6.1.4.2 Дозирующий прибор
Может быть использован дозирующий прибор компании Берингер Манхайм (Германия, кат.№745804), который дозирует образцы по 100 мг. Соответственно должно быть добавлено 10 мл буфера для экстракции.
гомогенизация
Суспензия фекалий должна быть тщательно перемешана при комнатной температуре (с использованием миксера). Фекалии должны быть гомогенизированные для полной экстракции панкреатической эластазы 1. После экстракции, продолжительностью более 5 мин, суспензия еще раз перемешивается. После оседания проводят разведения. Несмотря на то, что панкреатическая эластаза 1 достаточно стабильна, экстракцию можно оставлять (до 24 ч) при температуре 4-80С, и разведение делать на следующий день.
Разведение экстрактов фекалий (1: 500)
Подготовка к разведению 1: 500:
предварительное разведение (1:20): 50mл вытяжки фекалий + 1 мл тестового / моющего буфера.
Окончательное разведения (1: 500): 40 mл (1:20) + 1 мл тестового / моющего буфера.
6.1.7. Разведение дуоденального сока (1: 20000)
Подготовка к разведению 1: 20000
предварительное разведение (1: 100): 20 mл образца + 2 мл тестового / моющего буфера.
Окончательное разведения (1: 20000): 10mл (1: 100) + 2 мл тестового / моющего буфера.STD - стандарты; PC - положительный контроль; S1-S4 - образцы.
Пустые - ячейки А1 и А2 содержат 50 mл тестового / моющего буфера каждая.
Стандарты (синяя крышка) - пригодны для применения; накапать 50 mл каждого стандарта (нерастворенного) в полоски 1 и 2 раза соответственно:
           Стандарт 1 = 0,3 нг / мл
           Стандарт 2 = 1,0 нг / мл
           Стандарт 3 = 2,0 нг / мл
           Стандарт 4 = 4,0 нг / мл
           Стандарт 5 = 10,0 нг / мл
Контроль, пригодный для применения (фиолетовая крышка) накапать 50 mл к ячеек G1 и G2.
                Контроль = 4,0 нг / мл ± 10%
Накапать 50 mл вытяжки фекалий, разбавленной 1: 500 (или дуоденального сока 1: 20000), две пробы в две соседние ячейки.
Инкубировать 30 минут при комнатной температуре
Промывка: опорожнить ячейки и промыть каждую трижды тестовым / моющим буфером (8-канальной пипеткой, 250mл / ячейка). Перевернуть пластинку и постучать по чистой бумажной салфетке до полного удаления капель жидкости.
6.2.2 Инкубация со вторым типом антитела (анти Е1-био)
Добавьте 50mл / ячейка второй тип моноклональных антител, конъюгированных с биотином - анти Е1-Био (желтая крышка), (разведенный 1: 100 непосредственно перед использованием).
Для 4 тест-полосок (1/3 пластинки): 20 mл анти Е1-Био + 2 мл тестового / моющего буфера.
Для 6 тест-полосок (1/2 пластинки): 30 mл анти Е1-Био + 3 мл тестового / моющего буфера.
Для 12 тест-полосок (целая пластинки): 60 mл анти Е1-Био + 6 мл тестового / моющего буфера.
Инкубировать 15 минут при комнатной температуре
Промывка: опорожнить ячейки и трижды промыть каждую 250 mл тестового / моющего буфера.
6.2.3 Инкубация с ПОД - стрептавидин
Добавьте 50 mл / ячейка ПОД - стрептавидин (зеленая крышка), (разведенного 1: 400 непосредственно перед использованием).
Для 4 тест-полосок (1/3 пластинки) 5 mл ПОД - стрептавидин + 2 мл тестового / моющего буфера.
Для 6 тест-полосок (1/2 пластинки): 10 mл ПОД - стрептавидин + 4 мл тестового / моющего буфера.
Для 12 тест-полосок (целая пластинки): 15 mл ПОД - стрептавидин + 6 мл тестового / моющего буфера.
Инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темном месте
Промывка: опорожнить ячейки и трижды промыть каждую 250 mл тестового / моющего буфера.
6.2.4 Цветная реакция
Добавьте 100 mл пригодного к применению раствора субстрата (красная крышка к каждой ячейки).
Инкубировать 5 минут при комнатной температуре в темном месте
6.2.5 Остановка цветной реакции
Остановите реакцию с субстратом путем добавления 100 mл стоп - раствора (пригоден к применению, белая крышка) к каждой ячейки. Хорошо размешать содержимое ячеек путем встряхивания.
6.2.6 Измерение
Определите оптическую плотность при длине волны 405 нм с помощью микротитруючого пластинчатого считываю чего устройства в промежутке времени 5 - 30 минут после внесения стоп-раствора. Хорошо смешайте содержимое перед измерением. 492 нм может быть использована как эталонная длина волны.
6.3 Учет результатов
6.3.1 Неавтоматическая оценка
Подсчитайте среднюю оптическую плотность для каждого из двойных исследований.
Постройте график, на котором ось абсцисс - это Е 1- концентрация (нг / мл) стандартов, ось ординат - соответствующая оптическая плотность стандартов, которая определена при исследовании. Таким образом, Вы получаете стандартную кривую.
Концентрация Е1 в образцах может быть подсчитана по стандартной кривой на основании определенной оптической плотности.
6.3.1.1 Пробы фекалий
Для определения концентрации Е1 в фекалиях (мкг / 1г фекалий) необходимо значение концентрации, определенное по стандартной кривой, умножить на 50 (с учетом конечного разведения).
6.3.1.2 Дуоденальный сок
Для определения концентрации Е1 в дуоденального соке (в мкг Е1 / 1мл сока) необходимо значение концентрации, определенное по стандартной кривой, умножить на 20 (с учетом конечного разведения).
6.3.2 Учет результатов с помощью программного обеспечения ELISA
Расположите пустые, стандартные и исследовательские ячейки в соответствии с порядком, приведенным в таблице 1. Примените метод линейной регрессии. Умножьте определенную концентрацию на соответствующий коэффициент разведения или добавьте фактор разведения (фекальные пробы - фактор 50; дуоденальный сок - 20).
6.3.3. Эталонные показатели концентрации панкреатического эластазы 1
в фекалиях:
норма: 200-500 и более мкг Е1 / г фекалий
средняя и легкая экзокринной
панкреатическая недостаточность 100-200 мкг Е1 / г фекалий
тяжелая панкреатическая недостаточность <100 мкг Е1 / г фекалий
Вышеупомянутые концентрации Е1 определены для оформленных образцов фекалий. При установлении концентрации <200 мкг Е1 / г фекалий, при исследовании жидких образцов фекалий необходимо повторное исследование оформленных образцов (см. 1.7).
В дуоденальном соке:
Каждая клиника должна определить свои предельные показатели.

Новости медицины:


Резерв лекарств 0 шт.